凝乳酶原(凝乳酶)二硫键cys206-cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键cys206\|cys210进行定位突变过程中发现，在相应的模板序列中有自身形成自由能为-16.1kcal/mol的茎环结构倾向，妨碍与引物结合，从而难以合成突变的dna，采用快退火可解决此矛盾。5个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达，除c206a外，约占细胞总蛋白的50%左右。突变体的复性结果表明，cys206\|cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的，但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响，在5个突变体中，c206a/c210a的复性率分别为c206s/c210s\,c210a\,c210s的4.5倍、20倍和30倍，而c206a完全不能复性。c206a/c210a与c206s/c210s的远紫外cd光谱与野生型基本相同，其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变，而荧光强度有显著增加。由于上述3个蛋白具有相同比活，说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象，而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。