用绿色荧光蛋白基因作为筛选标记的新型克隆载体的构建

目前通常使用的质粒克隆载体，如puc系列、pgem系列和pbluescript等．都是以lacz’作为筛选标记的插入失活型载体。laez’编码β-半乳糖苷酶n端的一个片段，称为α-肽。异丙基-硫代半乳糖苷(iptg)可诱导α-肽的合成，它能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补(α-互补)，产生具有完整酶活性的二聚体。带有质粒载体的细菌在含有生色底物5-漠-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(x-gal)的培养基上生成蓝斑。外源片段插人到载体上位于lacz’5’端编码序列内的多克隆位点后，可阻断taez’编码序列。破坏α-互补作用。茁落形成白斑，因此可利用蓝/白斑显色平板筛选重组子。绿色荧光蛋白(greennfluorescentprotein，简称gfp)基因是一个新的标记基因[1]，来源于多管水母属的aequoreavictoria．编码238个氨基酸残基，分子量为2688da。经蓝光或紫外激发而发射绿色荧光。其吸收波长为395mm．发射波长为509nm[2]。gfp的生色基圈是由位于65～67位的ser、tyr和gly被修饰后共价连接而形成的。gfp构象非常稳定．不会发生光漂白，在异源细胞中表达的gfp能保持它的荧光特性[1,3]。gfp突变体gfps65t是用点突变技术将野生型gfp65位ser突变成thr。gfps65t吸收波长向可见光部分移动(490nm)．且吸收强度比野生型gfp增强6倍．可发射更强的绿色荧光[4]。由于gfp产生荧光不需要加入任何外源底物或辅助园子，在细菌细胞内高水平表达可使苗落呈现绿色，为此我们构建了以gfps65t基因作为筛选标记的新型克隆载体，建立了以绿／白斑显色平板筛选阳性重组的新方法，替代lacz’的蓝/白斑筛选法，且不需使用x-gal。