猪2型圆环病毒orf1与orf2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据genbank发布的猪2型圆环病毒(pcv2)序列(ay035820),设计两对特异性引物,采用pcr方法,分别扩增了猪2型圆环病毒orf1和orf2基因。将orf1和orf2基因的pcr产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gegi双缺失通用转移载体piecmv中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pieorf1-orf2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pieorf1_orf2与伪狂犬病毒tk-ge-lacz+基因组共转染ibrs_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测pcv2orf1基因和orf2基因的pcr方法筛选重组病毒tk-ge-gi-orf1-orf2+,用southernblotting鉴定重组病毒,并用westernblotting检测orf1_orf2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因orf1和orf2已成功插入到tk-ge-lacz+亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与pcv2阳性血清发生反应。同时发现orf1和orf2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性，其毒力与亲本株相当。