串珠镰孢霉d-泛解酸内酯水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用d_泛解酸内酯水解酶n末端序列,并根据ncbi中公布的d_泛解酸内酯水解酶cdna序列设计了一个特异引物,该引物结合oligo(dt)15,以串珠镰孢霉(fusariummoniliforme)cgmcc0536mrna反转录得到的总cdna为模板进行扩增,获得约15kb左右的片段,将其克隆到t载体上进行测序,对测得的序列进行分析,重新设计了一对引物,并在引物两端分别加上限制酶ecorⅰ和salⅰ的识别位点序列,利用热启动pcr成功地扩增出了d_泛解酸内酯水解酶基因,基因片段长度为1146bp,该序列同来源于尖镰孢霉菌(f.oxysporum)aku3702菌株的编码d_泛解酸内酯水解酶cdna结构基因的同源性为9006%。将所得片段定向克隆到ptrc99a载体中,转化至jm109感受态细胞,筛选出了阳性克隆。经iptg诱导阳性菌,进行sds_page电泳,检测出在约40kd处有一蛋白表达带。对两株重组基因工程菌的比活力进行测定,结果分别为37u和41u。