核酸酶p1的原核表达、纯化及酶学特性分析

为了建立一种核酸酶p1(nucleasep1，np1)的原核表达纯化系统，首先采用重叠延伸pcr将22段寡核苷酸拼接，获得人工合成的np1基因。将其克隆至分泌型表达载体pmal-p4x获得重组质粒pmal-p4x-np1，然后将重组载体转化t7express和origamib(de3)菌株诱导表达，利用amylose亲和层析柱纯化获得重组蛋白，并对其活性、热稳定性和金属离子依赖性进行系统分析。sds-page结果显示，重组蛋白mbp-np1(maltosebindingprotein-np1)在t7express和origamib(de3)菌株中均可表达，且以可溶性形式存在。活性检测表明origamib(de3)菌株中获得的重组蛋白活性高于t7express菌株(75.48u/mg:51.50?u/mg)；利用蛋白酶factorxa切除mbp标签后，两种重组蛋白的比活力均有提高，分别为258.13u/mg和139.20u/mg。重组np1表现出良好的热稳定性，80℃温浴30min后重组酶仍具有90％以上的活力。2.0?mmol/lzn2+对np1有比较明显的激活作用，相同浓度的cu2+则对该酶有强烈的抑制作用。该研究实现了np1在大肠杆菌系统中的功能性表达，为np1纯酶的制备提供一个替代途径。