单活性结构域t7核酸酶ⅰ的制备及性质研究

t7核酸酶ⅰ(t7eⅰ)是一种能特异识别并拆分重组中间体hollidayjunction(hj)的多功能核酸酶，该酶不仅能特异识别和拆分hj，而且能随机切刻双链dna，特异识别并切割双链dna中的切刻和单碱基错配位点．构建了两种原核表达载体用于表达mbp和his-tag融合的两种t7eⅰ突变体，mbp-t7eⅰ(e20k)和his6-t7eⅰ(e65k)．每一种融合蛋白形成的同源二聚体不具有核酸酶活性，通过共表达或两种蛋白质共变性复性、双标签亲和纯化，最终获得具有单个活性结构域的t7eⅰ异源二聚体(t7eⅰ-sad)．以puc(at)和puc19为底物测试t7eⅰ-sad的hj拆分活性、随机切刻活性和切刻位点切割活性，结果显示，t7eⅰ-sad可特异识别并切刻hj结构，但丧失了同时引入两个切刻位点的能力，其对puc(at)的特异切刻活力和对puc19的随机切刻活力与野生酶相当．逐级变性梯度洗脱实验显示，t7eⅰ-sad的稳定性与野生型酶接近，二聚体解离需要5.0～6.0mol/l尿素或1.75～2.0mol/l盐酸胍；凝胶阻滞实验表明t7eⅰ-sad具备与hj结构特异结合的能力．为具有细胞毒性蛋白的表达提供了一种新策略，同时提供了一种简便直观的蛋白质二聚体稳定性测试方法．