信号转导和转录激活因子3调节肿瘤坏死因子α表达的结合位点研究

脓毒症早期内毒素(脂多糖，lps)可激活丝裂原活化蛋白激酶通路，诱导肿瘤坏死因子α(tnf-α)等多种炎性细胞因子大量生成．tnf-α作为一种重要的早期炎症介质，间接激活janus激酶/信号转导和转录激活因子(jak/stat)通路．stats活化后直接进入核内参与lps诱导的基因表达．本研究拟探讨stat3在tnf-α启动子上的作用位点，为深入认识jak/stat信号通路在脓毒症发生中的分子基础及其干预途径提供理论依据．a．将flag-stat3与全长tnf-α启动子报告基因共同转染cos-7细胞，观察stat3作用的剂量-效应．结果证实，stat3对tnf-α基因的表达不受lps调节，无论是否有lps刺激，随着stat3剂量的增加，tnf-α基因的表达亦随之增加．在将200?滋g/l浓度的flag-stat3质粒分别与不同长度的tnf-α启动子报告基因质粒共同转染cos-7细胞并用lps刺激，观察不同片段的tnf-α启动子活性．结果发现，95bp片段的tnf-α缺失突变体作用最为明显，增加了6.9倍．b．分别构建了70bp、75bp、80bp和85bp片段的tnf-α缺失突变体——ptnf-α(70bp)、ptnf-α(75bp)、ptnf-α(80bp)和ptnf-α(85bp)，将它们与flag-stat3共同转染cos-7细胞并用lps刺激，观察到85bp片段的活性与95bp片段相似，当片段到达80bp时，活性降低到对照水平．为了进一步了解其精确结合位点，将85bp片段突变体的81和82位碱基突变，检测其对tnf-α活性影响，发现启动子活性下降．c．为了证明stat3的潜在结合位点在80bp到85bp之间，且81和82位这2个位点的突变确实改变了stat3对tnf-α启动子活性，进行凝胶迁移阻滞实验，观察到tnf-α启动子62～85bp的野生型γ-32p标记的探针可以与核蛋白stat3结合，而突变的62～85bp标记的探针不能与核蛋白stat3结合．上述结果表明，stat3对tnf-α基因表达的调节不依赖lps的刺激，stat3在tnf-α启动子的潜在结合位点是在80到85碱基片段之间．