睾酮假单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建及表达

从土壤中分离睾酮假单胞菌，提取其基因组dna，pcr扩增3α-羟类固醇脱氢酶（3α-hsd）基因，将扩增产物用ndeⅰ/bamhⅰ消化，切下目的基因片段克隆到质粒pet-15b中构建重组pet-15b.将重组pet-15b转化入e.colidh5α中，经酶谱分析和测序，鉴定出正确的重组质粒pet-15b.将重组pet-15b转化入宿主菌e.colibl21(de3)plyss中，用硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导表达.提取细菌总蛋白质进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分析并测定酶活性.粗提物中酶活性高达2.45×105u/l.利用重组蛋白中的6个组氨酸(his)组成的“标签”进行亲和层析，经一步金属螯合亲和层析纯化后，重组蛋白在sds-page上呈现出均一的单一条带，回收率达68%.活性和纯度均较高的目的蛋白3α-hsd的获得，为血清总胆汁酸酶循环法测定奠定了基础.