腺病毒载体介导pdx-1在骨髓间充质干细胞中的表达

为研究pdx-1基因在骨髓间充质干细胞中的表达情况及生物学功能的发挥，构建了含pdx-1基因的重组腺病毒载体.酶切pdx-1基因并连入穿梭质粒padtrack-cmv.用电穿孔法使穿梭质粒padtrack-cmv-pdx-1与病毒骨架质粒padeasy-1在大肠杆菌bj5183中同源重组.利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞，包装出完整的腺病毒.分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞.用重组腺病毒感染间充质干细胞.用荧光显微镜、rt-pcr、免疫荧光染色等方法检测pdx-1、胰岛素基因及蛋白质的表达，用放射免疫分析法检测转基因细胞分泌胰岛素情况.结果表明:通过测序、pcr、酶切等鉴定pdx-1基因已正确插入穿梭质粒中，并与病毒骨架质粒重组.重组腺病毒滴度为6.3×107pfu/ml.通过荧光显微镜观察证实重组腺病毒可高效感染骨髓间充质干细胞，经rt-pcr、免疫荧光染色证实转染pad-pdx-1后培养7天的细胞中有pdx-1及胰岛素基因的表达.这些转基因的细胞向胞外分泌的胰岛素量为(15.21±3.50)miu/l.