短发夹rna介导rna干扰的时间和剂量效应研究

用rna干扰(rnainterference，rnai)技术抑制哺乳动物细胞中外源报告基因的表达，以探讨该过程中rnai作用的剂量和时间效应.应用lipofectamine2000将外源报告基因的表达载体与编码短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)的质粒共转染hek293h细胞，观察shrna载体对报告基因的抑制效应.转染后，shrnas的瞬时表达可特异地抑制细胞内报告基因的表达.在共转染后12，24，48，60，72，96h时检测egfp(enhancedgreenfluorescentprotein，egfp)基因mrna及蛋白质表达水平，结果显示，egfpmrna及蛋白质表达在12h时略有降低，24~48h时表达逐渐降低，48~72h时降低最明显，其后egfp表达水平逐渐恢复.提示该过程中rnai效应呈现由弱到强、又由强到弱的逐渐消逝趋势.共转染一系列剂量比例的egfp干扰载体与靶载体的结果表明，在一定剂量范围内，rna干扰载体所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关，当其剂量进一步加大足以抑制外源基因表达时，抑制效应则维持在一“平台期”.此外，通过rnai抑制hela细胞、hek293细胞中荧光素酶基因的表达，荧光素酶活性变化也表现出上述类似的效应.这些结果表明，在体外哺乳动物细胞中，基于表达载体的rnai作用呈现剂量和时间依赖性效应.这为基于载体表达的rnai技术应用研究提供了一定的理论参考及依据.