人clec-2胞外段crd重组蛋白纯化与多克隆抗体的制备和活性鉴定

人c型凝集素样受体(humanc-typelectin-likereceptor-2，hclec-2)是新克隆的ⅱ型跨膜受体分子，研究表明，它在病毒感染，血小板活化、聚集，肿瘤转移和信号转导等方面发挥重要作用．通过制备针对其胞外段糖类识别结构域(crd)的抗体来进一步研究该蛋白质的生物学功能及相关信号通路．构建了pet23b-crd重组表达质粒，将其转化到大肠杆菌bl21中，用于hclec-2-crd-his融合蛋白的表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明，融合重组蛋白成功获得了高效表达，分子质量在18ku左右．经鉴定，发现hclec-2-crd-his表达于包涵体中．为获得高纯度的可溶性蛋白，将包涵体溶于6mol/l盐酸胍，并用镍柱进行纯化．纯化后的蛋白质经过透析、再折叠后作为抗原，免疫家兔制备抗血清，抗血清经蛋白g亲合层析纯化后用westernblot等方法进行鉴定，结果显示该抗体能特异性地检测到gfp-hclec-2和gfp-crd．通过使用该抗体，进一步发现，在用pma和il-4诱导单核细胞thp-1分化的过程中，内源性hclec-2蛋白水平下调，初步揭示了hclec-2的表达和单核细胞的分化存在一定的联系．因此，该抗体的成功制备将为进一步研究clec-2的生物学功能提供有利的条件．