全人源抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选鉴定

体外致敏并用ebv转化肝癌患者的pbmc．用pcr分别扩增vh和vl基因并组成scfv基因．将scfv基因与载体fuse5连接后，电击转化大肠杆菌mc1061，构建噬菌体呈现型scfv库．用人肝癌细胞及人肝细胞对初级噬菌体抗体库进行亲和富集及phage-elisa筛选．筛选获得的阳性克隆进行elisa及免疫组化鉴定并测序．结果表明，经ebv转化的4例肝癌患者pbmc，elisa检测均有抗肝癌抗体产生，经多次pcr，扩增出6种vh(γ、μ)和9种vl(κ、λ)基因，经连接组成54种scfv基因．将scfv基因与载体连接后，导入大肠杆菌mc1061，得到库容为1.0×108的初级噬菌体抗体库，全长scfv基因的插入率为80%．用人肝癌细胞系hepg2和人肝细胞系qsg-7701对抗体库进行三轮正负淘选和富集后，从中随机挑取533个克隆进行elisa筛选，得到179个阳性克隆，阳性率为33.6%．将179个阳性克隆进一步进行其他细胞系的鉴定，发现克隆a82对肝癌细胞系hepg2、人胚肾上皮细胞系hek293呈强阳性反应，免疫组织化学结果显示与人肝细胞癌组织有特异性反应，而不与正常肝组织反应．且a82的相对亲和力为2.4mol/l，解离常数kd为5.32×10-9mol/l，显示其亲和力较高．对克隆a82进行测序分析，结果表明：a82全长742bp，含linkercdna序列45bp，重链可变区基因与人胚系igvh3-23有94.3%的同源性，轻链可变区基因与人胚系igv4-2有94.9%的同源性，v-d-j分别属于vh3-23-d2-21-jh6-linker-v4-2-jl2．由上述结果可见，应用体外抗原致敏方法和ebv转化技术联合噬菌体抗体库技术，构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌单链抗体库，通过细胞elisa和免疫细胞化学鉴定，获得的噬菌体抗体克隆a82具有较强的特异性，为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础．