烟草坏死病毒a诱导的基因沉默及其条件优化

以烟草坏死病毒a中国分离物(tobacconecrosisvirusachineseisolate,tnv-ac)侵染性cdna克隆为基础，通过基因替换、基因插入策略构建获得多种重组tnv-ac，比较了外源基因片段插入位置、插入形式及接种植物培养温度对tnv-ac诱导的基因沉默的影响．外源基因片段替换cp基因19～828nt的重组tnv-ac丧失了在本生烟中的系统移动能力，也不能有效诱导相应基因发生明显的沉默，说明替换策略不适合于tnv-ac．向cp基因终止密码子uag附近插入外源基因片段后，tnv-ac仍可进行复制，但最适的插入位点位于uag之后，且容纳外源片段的长度约为120nt．当外源片段以反向重复的形式插入uag之后，诱导基因沉默的效率较高．接种植物的培养温度也会显著影响基因沉默的效率以及插入片段的稳定性，低温(18℃)条件下诱导nbpds基因沉默的效率明显高于高温(24℃)条件，且沉默表型可持续110天以上．除了本生烟pds基因，tnv-ac沉默载体还可诱导本生烟sulfur基因su和镁离子螯合酶h亚基基因chlh发生沉默，以上结果说明，tnv-ac具有开发为本生烟基因功能鉴定的新vigs载体的潜力．