氨基酸序列突变对tfpi生物半衰期和生物活性的影响

通过对个别氨基酸突变的研究，获得了保持良好生物活性的长半衰期组织因子途径抑制因子(tissuefactorpathwayinhibitor，tfpi)重组蛋白的有效途径.采用定点诱变和基因重组技术，首先在tfpicdna特定位点形成一个位点的沉默突变，以提高tfpi在毕赤酵母细胞内的表达量，此cdna称为mtfpi.在此基础上，通过系列位点突变，形成3个羧基端突变体：m0tfpi、m1tfpi和m2tfpi.将上述4种tfpicdna与表达质粒ppic9连接，转染大肠杆菌，通过pcr和dna测序确认重组质粒，转染酵母细胞gs115，甲醇诱导表达重组蛋白.采用层析方法纯化tfpi重组蛋白，用125i标记重组蛋白，静脉注射给药，比较四者在sd大鼠体内血浆代谢清除速度.用底物显色法测定重组蛋白抑制凝血因子xa(fxa)的活性，比较各株tfpi重组蛋白突变体在体内、体外对fxa的抑制作用及肝素对各株tfpi重组蛋白功能的影响.结果显示，相比野生型tfpi重组蛋(mtfpi)而言，3株羧基端突变体m0tfpi、m1tfpi、m2tfpi在sd大鼠体内血浆代谢清除时间均有不同程度延长，其生物代谢半衰期分别是mtfpi的1.5倍、1.9倍和大于2倍，与m-tfpi相比，3个rtfpi突变体在体内、体外抑制fxa的作用无明显减弱，与肝素的结合能力及协同能力也无明显减弱.结果表明，m0tfpi、m1tfpi和m2tfpi在生物半衰期得到明显延长的同时，仍保持良好的抑制fxa的生物活性.