人胚鼻咽上皮细胞cdna文库的构建及鼻咽癌相关基因的筛选

为了进一步分离人鼻咽组织特异性表达基因和鼻咽癌特异相关基因，采用smart(switchingmechanismat5′endofrnatranscript)技术，构建了人胚鼻咽上皮cdna文库.从原代培养的人胚鼻咽上皮分离总rna并纯化mrna，利用经修饰的oligo（dt）引物（含sfiⅰb酶切位点）合成cdna第一链，同时根据真核生物mrna5′端帽子结构特点，利用smart核苷酸（含sfiⅰa酶切位点）作为cdna第一链在mrna5′端延伸出去的模板，进而以此序列为引物利用ld-pcr（long-distance-pcr）合成双链cdna，双链cdna经sfiⅰ(ⅰa和ⅰb)酶切和过柱分级分离后，克隆入经sfiⅰ酶切的λtrip1ex2载体后经体外包装而成cdna文库.结果表明，原始人胚鼻咽上皮cdna文库获得1.0×106个重组子，重组率达96%.文库扩增后，滴度达7.8×109pfu/ml，插入cdna平均长度为1.2kb，用pcr从该文库扩增出本实验室新克隆的鼻咽癌相关基因nag4的全长cdna.构建的人胚鼻咽上皮cdna文库具有良好的质量，该cdna文库为进一步筛选、克隆鼻咽癌抑癌基因及鼻咽组织特异性表达基因奠定了基础.