人线粒体trnaleu（uur）基因氧化损伤与修复研究

人mtdna比核dna更易受到自由基的氧化损伤,这些损伤可以被线粒体内的dna修复机制所修复,损伤与修复是决定突变是否产生的两个重要因素.为了确定氧化损伤与损伤后修复对mtdna突变的具体影响,采用四氧嘧啶处理lo2细胞,这种试剂进入细胞后,经氧化还原反应生成的自由基与线粒体自身代谢产生的自由基类似,然后观察自由基对细胞mtdna的氧化损伤与损伤后dna修复的动力学变化.由于线粒体的正常功能为修复机制所必需,采用mtt细胞活力实验检测不同浓度四氧嘧啶处理下线粒体酶活力,发现9mmol/l四氧嘧啶培养细胞1h后,线粒体琥珀酸脱氢酶功能在撤去药物后0,2,8和24h时间点均无明显变化.提取各组细胞的mtdna,用endoⅲ和fgp两种酶切除受氧化损伤的核苷酸,然后用碱性琼脂糖凝胶电泳分离大小不等的mtdna,进行dna印迹实验,地高辛-抗体-碱性磷酸酶系统显色,检测完整与断裂的mtdna量,利用poisson公式（s=－lnp0/p,p0为未断裂链光密度值,p为所有链光密度值总和）计算一个mtdna分子的平均损伤频率,结果显示,9mmol/l四氧嘧啶处理细胞1h,链平均损伤频率由对照的0.11个/分子增加至5.60个/分子,明显增加了mtdna上核苷酸的氧化损伤,除去药物后8h,绝大部分损伤可被修复,损伤频率减至0.40个/分子,除去药物后24h核苷酸的氧化损伤恢复至正常水平.采用接头介导pcr（lm-pcr）检测mttl1基因区域内单个核苷酸的损伤与修复动力学.这种方法可以检测各组mtdna上mttl1基因75bp区域内单个核苷酸损伤的部位及频率.结果显示,人mttl1基因存在20个易受氧化损伤的核苷酸热点,经与相应区域内文献报道的16个突变热点比较,有12个热点部位重合,而修复未显示热点部位或区域.结果提示,自由基对核苷酸的选择性氧化损伤是决定mtdna点突变发生及发生部位的主要原因.