一种大规模制备双链rna的简单方法及其在斑节对虾中的应用

rna干扰(rnai)是由双链rna(dsrna)诱发的特异性沉默目的基因表达的过程,一种大规模制备双链rna的方法可以便利rnai技术的应用。以斑节对虾kazal型蛋白激酶抑制剂(kpi)基因为例,详细介绍了一种以体内载体表达大量制备dsrna(>300nt)的方法。使用商业载体pgemt和pdrive,以2步克隆法构建含有发夹环(hairpinloop)dsrna表达载体,转化rna酶ⅲ缺陷的大肠杆菌ht115(de3)进行体内转录制备dsrna。构建的发夹rna表达载体含有494bp的正向靶序列和403bp的反向互补靶序列,其中正向靶序列多出的91bp即可成为loop环,而无需再次克隆加入。培养30ml的细菌,即可得到1mg纯化的dsrna,而其成本仅为使用商业化体外转录试剂盒的四分之一。为评估rnai效果,按照每1克虾体肌肉注射2μgdsrna的剂量,在dsrna注射后0,6,12和24h采集血淋巴,rtpcr检测kpimrna的基因转录水平。与对照组gfpdsrna和nacl注射组相比,kpidsrna注射组可以在24h内沉默血淋巴中的kpi基因。结果表明该方法是可大规模制备长的dsrna的方法。