罗非鱼hsp70(thsp70)蛋白的生物信息学分析、真核表达及质谱鉴定

运用生物信息学技术分析罗非鱼热休克蛋白70(tilapiaheatshockprotein,thsp70)的理化特性、糖基化位点、跨膜区域、蛋白的细胞定位及信号肽与虹鳟等其他动物hsp70的相似性,以人工合成cdna为模板,通过聚合酶链式反应扩增其完整cds,并将此dna片段与真核表达载体pgapza-a连接,构建pgapza-hsp70表达质粒,在毕赤酵母gs115中表达thsp70蛋白,对表达上清液进行sds-page及western-blotting分析后,采用ni2+ida层析脱盐纯化目的蛋白,并对所表达的蛋白进行糖基化pas染色鉴定。对表达的蛋白进行sds-page后,将所获得的非预定大小(约100ku)条带进行电离飞行时间质谱鉴定,并确定其蛋白种类。结果表明:thsp70所含氨基酸数量为640,分子量为70274.5u,等电点为5.49。在哺乳动物网织红细胞(体外)的半衰期为30h,在酵母内半衰期大于20h,而在大肠杆菌内的半衰期也大于10h,不稳定指数为36.64,脂肪族指数为85.58。可能分别含有6个n-和o-糖基化位点,所克隆thsp70基因与目的基因完整编码区序列完全一致,所构建的pgapza-hsp70质粒能在gs115中成功表达,诱导表达上清液经sds-page及western-blotting分析后发现,除70ku目的蛋白外,还出现一条100ku条带。经糖基化pas染色证明,此100ku蛋白可能是hsp70糖基化的结果,且能被人的兔抗hsp70抗体识别,质谱鉴定证明该条带即是thsp70蛋白。本研究所表达thsp70蛋白为后续罗非鱼细胞学及抗原提呈等免疫学研究奠定了基础。