太平洋鳕rag1和igm基因荧光定量pcr方法的建立及初步应用

为研究太平洋鳕发育早期特异免疫系统形成的机制,通过rag1和igm基因的转录水平衡量特异免疫系统的发育特点。根据genbank中rag1和igm的序列信息,分别设计1对特异引物,从太平洋鳕头肾中扩增得到rag1和igm的基因片段。将所获基因片段分别插入到克隆载体pmd18-t中,从而构建太平洋鳕rag1和igm基因的质粒标准品。建立并优化太平洋鳕rag1和igm基因绝对荧光定量pcr方法。为进一步验证该方法的可靠性,分别利用绝对定量和相对定量检验目的基因在太平洋鳕早期发育过程不同组织内的表达差异。以优化后的绝对荧光定量pcr方法检测不同发育时期太平洋鳕rag1和igm的表达情况。结果显示,rag1的回归方程为y=-3.266x+33.77,回归系数r2=0.996;igm的回归方程为y=-3.119x+27.61,回归系数r2=0.998。绝对定量和相对定量结果在基因转录趋势上显现出一致性,即rag1基因在胸腺和头肾中表达,且在胸腺中的表达量显著高于头肾中的表达量,在肝脏和脾脏中无表达;igm基因在胸腺、头肾、肝脏和脾脏中均有表达,其中脾脏中表达量最高,其次是头肾。rag1基因在太平洋鳕发育早期的表达水平很低,到61日龄(dayspost-hatching,dph)至95dph表达量显著提高;igm基因在早期表达水平同样很低,到33dph至61dph才有明显表达,在95dph时表达量显著提高。研究表明,本实验方法可靠,特异性较强,可成功对目标基因转录水平进行检测。