鲤外周血白细胞蛋白酶体激活因子pa28β全长cdna的克隆、鉴定及其差异表达分析

采用基因文库筛选方法,克隆了鲤外周血白细胞蛋白酶体激活因子pa28βcdna，对其序列进行了分析，同时利用半定量反转录聚合酶链式反应（rt-pcr）方法检测了不同外界因子刺激下鲤外周血白细胞pa28β的表达情况。结果显示，用dd-rtpcr的方法获得差异显示片段a18，经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤外周血白细胞cdna文库进行核酸杂交筛选，从0.8×104个重组噬菌体中，经过两轮筛选获得阳性克隆。序列分析表明，该阳性克隆长1175bp,含有一个大小为735bp编码244个氨基酸的完整开放阅读框，为编码鲤蛋白酶体激活因子pa28β的全长cdna。系统发生分析其与已报道的斑马鱼蛋白酶体激活因子pa28β亲缘关系最近，基因序列的同源性达95﹪。分离培养鲤外周血白细胞，在不同条件下经pha和cona刺激后，利用trizol提取总rna，根据得到的pa28β全长cdna序列和鲤β-actin序列设计引物，利用rt-pcr方法对鲤外周血白细胞pa28β进行差异表达分析，结果表明：经有丝分裂原刺激后前期（4h）白细胞中pa28β的表达量明显增大，但随着时间推移(12h、24h)表达增加量有所降低，并不随时间的延长而持续增加。在刺激的和正常的白细胞中pa28β表达趋势都成抛物线图，不同的是经刺激的比正常的pa28β的表达量提前达到峰值。首次报道鲤蛋白酶体激活因子pa28β的全长cdna序列，鲤pa28β的cdna序列genbank注册号为eu255233，并对其进行差异表达分析，这些结果可为pa28β在鱼类免疫应答中的作用研究提供参考和依据。