三疣梭子蟹卵黄磷蛋白纯化及其elisa测定方法

采用凝胶过滤层析法纯化了三疣梭子蟹成熟卵巢的卵黄磷蛋白(vitellin,vn),采用变性凝胶电泳(sds-page)确定了vn亚基数量和分子量,以纯化的vn为抗原,制备了三疣梭子蟹vn多克隆抗血清,纯化后得到vn抗体,在此基础上比较和优化了三疣梭子蟹vn测定的酶联免疫吸附法(elisa)参数,建立了稳定的三疣梭子蟹vn含量测定的elisa方法。结果表明:(1)sds-page显示三疣梭子蟹成熟卵巢中的vn含有分子量为100、75和66ku的3个亚基,western-blotting检测表明,这3个亚基均具有较强的免疫特异性;(2)样品直接包被法比双抗体夹心法具有更高的线性相关性,vn抗体最佳稀释倍数为1∶90000,最佳包被时间为8h,一抗和二抗反应时间分别为2h和1h,显色时间为20min;(3)该方法定性检测的灵敏度为14.9ng/ml左右,标准曲线方程为y=0.0009x+0.3991(r2=0.9861),其中x和y分别代表vn浓度和od450值,工作范围为200～900ng/ml;(4)应用该方法测定三疣梭子蟹卵巢中vn含量,结果表明,批次内和批次间平均变异系数分别为3.59%和3.10%,重复性良好。