缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶2(dgat2)的基因特性与功能鉴定

酰基-coa:二酰甘油酰基转移酶(dgat)是三酰甘油(tag)合成过程中的关键酶。在缺刻缘绿藻转录组测序数据库中,通过同源搜索,发现了1个编码dgat2的cdna全长序列。该序列长1997bp,其中,5’-非转录区(utr)长44bp,3’-utr长897bp,开放阅读框(orf)长1056bp,编码一个351个氨基酸的蛋白质,预测的分子量为39.43kd,等电点为9.46。基于缺刻缘绿藻和其他物种相应的dgat基因编码蛋白序列所构建的neighbor-joining(nj)系统进化树,结果表明该基因与dgat2聚成一支,显著不同与dgat1和dgat3。氨基酸序列比对发现,该基因含有dgat2所具有的hphg这4个氨基酸所组成的高度保守特征序列。因此,将该基因命名为midgat2基因。将它的cdna与其dna序列进行比较后发现,midgat2基因含有6个内含子,其剪切位点均符合“gt-ag”规则。为进一步了解其功能,利用反转录pcr克隆了该基因的orf序列,然后将其亚克隆到表达载体pyes2中,成功地构建了重组表达质粒py-midgat2。通过电穿孔法将该重组质粒转入酿酒酵母tag合成缺陷株h1246中,经筛选与序列验证得到含有重组质粒py-midgat2的酵母转化株。酵母转化株在用sc培养基并加入半乳糖诱导表达培养后,其脂类的薄层色谱分析结果表明,所转的midgat2基因能使酵母转化株恢复tag合成的能力,从而证实了midgat2基因具有dgat的功能；利用荧光染料bodipy对酵母细胞的染色结果显示,midgat2基因能使酵母转化株的细胞重现油滴,尽管重建的油滴大小明显比野生型酵母的小。这些研究为缺刻缘绿藻tag合成代谢途径与调控机理的探讨奠定了基础。