米曲霉pyrG 基因克隆及其同源转化系统的建立

建立以乳清酸核苷-5＇- 磷酸脱羧酶基因(pyrG)为选择标志，以米曲霉为宿主菌的同源转化系统。以米曲霉基因组为模板，通过PCR 扩增获得pyrG 基因，将该片段与表达载体pMD18-T 相连，转化大肠杆菌DH 5α，经蓝白斑筛选、PCR 快速筛选、酶切和测序验证，获得重组质粒pMD-pyrG，完成pyrG 基因的克隆。序列分析表明该基因与米曲霉KBN616 的pyrG 基因编码序列的同源性为99.9%，两者经推导的氨基酸的同源性为99.6%。以米曲霉 pyrG 营养缺陷株为受体菌，通过PEG/CaCl2 诱导的原生质体转化方法，将重组质粒导入该受体菌，使米曲霉pyrG 缺陷株发生基因转化，成为pyrG+，由此成功建立了以pyrG 为筛选标记基因、同型米曲霉pyrG 基因缺陷株为受体菌的基因转化系统