阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因克隆、表达及活性研究

？目的:利用pet质粒原核表达体系克隆、表达阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,表达产物进行ni-nta柱纯化,利用α-葡萄糖苷酶分解4-硝基苯基-α-d-呋喃型葡萄糖的特性进行表达纯化合的蛋白活性鉴定,为进一步制备阪崎肠杆菌检测用单克隆抗体奠定了基础。方法:从阪崎肠杆菌atcc29544标准菌株中克隆获得阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,连接pet22b(+)表达载体后转化大肠杆菌bl21(de3)菌株,利用不同浓度的异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)诱导表达外源基因,分别检测不同诱导时间、不同浓度iptg作用下表达产物,筛选高表达菌株。表达菌株大量培养后,超声波及蛋白酶k作用破菌,ni-nta亲和柱纯化目的蛋白,纯化产物进行酶活性的测定。结果:克隆获得的α-葡萄糖苷酶基因与ncbi收录的基因序列属等位基因,核苷酸位点有多处差异,氨基酸序列也有不同。构建表达载体并诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测,目标蛋白相对分子质量约为65kd,与理论值相符。目标蛋白量约占菌体总蛋白量的18%。同时,由纯化结果可以看出,以500mmol/l咪唑洗脱时的纯化效果最理想,蛋白纯度可达90%以上。对表达产物进行过酶活性初步检测证明,重组的阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶能够分解4-硝基苯基-α-d-呋喃型葡萄糖,产生蓝绿色。结论:本研究中克隆获得了阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,通过构建pet22b(+)-glu表达质粒转化大肠杆菌可获得基因重组的高表达菌株,表达产物具有较好的酶活性,纯化后纯度可达90%以上。