抗克伦特罗核糖体展示单链抗体库的构建及鉴定

？构建大容量核糖体展示抗克伦特罗单链抗体(single-chainfragmentvariant，scfv)文库，为进一步筛选抗体奠定基础。用克伦特罗人工抗原免疫小鼠，分离其脾细胞；trizol法抽提总rna，反转录成cdna，pcr及重叠延伸pcr法构建核糖体展示scfv文库。再通过pcr和重叠延伸pcr在scfv文库序列5＇端添加t7启动子、茎环结构、核糖体结合位点，3＇端添加间隔区序列(t20-v109)、茎环结构构建核糖体展示抗克伦特罗scfv文库。核糖体展示scfv文库与easyt3载体连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑取5个阳性克隆双酶切和测序鉴定。结果表明：用于建库材料的免疫小鼠效价为1:128000；成功扩增重链可变区基因大约为360bp和轻链可变区基因大约为330pb；核糖体展示scfv文库基因大约1200bp；库容量达1.75×1013；阳性重组质粒均含有1200bp插入片段；利用imgt/v-quest数据库对单链抗体可变区进行序列分析结果表明，重链可变区和轻链可变区基因均由胚系基因重排得到，且与鼠源胚系基因同源率都达84%以上；氨基酸序列比对结果表明，重链可变区氨基酸序列同源率为37.82%，轻链可变区氨基酸序列同源率为39.09%。其中多样性主要发生在vh-cdr3、vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3。成功构建了大容量抗克伦特罗单链抗体核糖体展示文库。