重组人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶的克隆表达及应用

克隆、表达人和大鼠醇脱氢酶(adh)、醛-酮还原酶(akr)基因全长cdna,研究扁桃酸(ma)代谢机制。设计引物,利用rt-pcr克隆人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶基因全长cdna。测序正确的cdna被克隆到表达载体pet-28a(+)上并在大肠杆菌bl21(de3)中稳定表达。利用亲和色谱纯化相应的酶,通过检测其在340nm吸收度值的变化进行酶活性测定。获得的醇脱氢酶与扁桃酸,醛-酮还原酶与苯乙酮酸(pga)共孵育,采用hplc分析其代谢和转化情况。通过测序,目的蛋白的cdna序列完全正确,在宿主菌中获得良好的可溶性表达,经ni2+亲和柱纯化后目的蛋白达到了电泳纯,具有较好的催化活性。人adh2对扁桃酸的代谢具有立体选择性,优先代谢s-ma,对s-ma的代谢能力较强。大鼠adh1对扁桃酸无代谢活性,人和大鼠akr对苯乙酮酸均无代谢。成功构建人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶的表达质粒,获得高活性的蛋白。这些重组酶模型可以用于由醇脱氢酶和醛-酮还原酶介导的药物代谢研究。