引入糖基化位点和l303e/f309s突变促进intein介导的断裂凝血viii因子剪接

作者最近证明intein的蛋白质剪接技术可用于双载体转b区缺失型fviii(bdd-fviii)基因,在此？基础上,本研究将具有促fviii分泌作用的l303e/f309s双突变和b结构域糖基化位点引入bdd-fviii重链,？观察重链变体对intein剪接的bdd-fviii蛋白分泌和活性的影响。用分别融合sspdnabintein的重链变体(dmn6hcintn)和轻链(intclc)基因共转染培养的293细胞,用elisa分析分泌至培养上清液中的剪接bdd-fviii蛋白量,并用发色法检测培养上清液的凝血生物活性。结果显示,dmn6hcintn和intclc共转基因细胞上清液中剪接bdd-fviii的浓度为(149±23)ng·ml？1,活性为(1.12±0.14)u·ml？1,明显高于intein融合的野生型重链(hcintn)与轻链(intclc)共转基因细胞[(99±14)ng·ml？1和(0.77±0.13)u·ml？1],提示重链变体能明显促进剪接bdd-fviii蛋白的分泌和活性;另外,还检测到不依赖细胞机制的bdd-fviii剪接。本研究为进一步动物体内双aav载体转bdd-fviii基因研究提供了依据。