蛋白反式剪接的人/猪嵌合体bdd-fviii及其分泌的改善

本研究采用具有促分泌作用的猪fviii分子的a1和a3区,替换人fviii分子的相应结构,构建人/猪嵌合体bdd-fviii(bdd-hpfviii),利用sspdnabintein的蛋白质反式剪接功能,双载体培养的cos-7细胞瞬时共转嵌合体bdd-hpfviii基因。免疫印迹法观察了转基因细胞内的蛋白表达和bdd-hpfviii的剪接,采用elisa和coatest法分别观察了分泌至培养上清液中剪接的嵌合体bdd-hpfviii蛋白和生物活性。结果显示,？？基因共转染细胞内可见明显的剪接bdd-hpfviii蛋白,分泌至上清液的剪接bdd-hpfviii蛋白量为(340±64)ng·ml？1,活性为(2.52±0.32)u·ml？1,明显高于双载体共转人bdd-fviii基因细胞[质量浓度为(93±22)ng·ml？1,活性为(0.72±0.13)u·ml？1],提示intein介导的双载体共转bdd-hpfviii基因可明显促进剪接蛋白的分泌。另外,分别转intein融合bdd-hpfviii重链和轻链基因的细胞混合培养后上清液中仍可检测到剪接的bdd-hpfviii蛋白及其活性,分别为(44±9)ng·ml？1和(0.32±0.07)u·ml？1,提示intein可进行不依赖细胞机制的bdd-hpfviii剪接。本研究为旨在提高分泌的动物体内应用intein的双载体转bdd-hpfviii基因奠定了基础。