应用核糖体展示技术高效筛选人源抗ige单链抗体

本研究从哮喘患者外周血分离淋巴细胞、提取总mrna,采用rt-pcr技术分别构建重链可变区vh(variableregionofheavychain)和轻链可变区vl(variableregionoflightchain)cdna库,然后通过连接肽(gly4ser)3和特定引物将vh和vlcdna基因组装成人源单链抗体(scfv)核糖体展示模板基因库。应用兔网织红细胞核糖体展示技术,单引物原位反转录技术,经3轮展示富集并回收针对人源ige蛋白(免疫球蛋白e)的目的单链抗体基因;回收的抗体基因经双酶切后与pet22b(+)载体连接,转化至e.colirosseta(de3)宿主细胞,应用菌落pcr结合dotblotting技术快速鉴定阳性克隆,抗原elisa法进一步鉴定阳性克隆。vh和vl基因库得到正确的构建,长度分别为400和710bp,库容为1013。核糖体展示模板构建正确,长度为1100bp。该基因库经过3轮针对ige蛋白的核糖体展示,目的基因得到了有效富集和回收。经过高效克隆、表达和鉴定,确定1株针对人ige蛋白显示最强亲和力的阳性克隆菌pet-ige-6。经测序和序列分析证实该单链抗体为人源抗体,序列未见国内外报道。结果表明,采用患者外周血构建人源抗体基因库,结合核糖体展示技术,可以成功获得高亲和力的人源单链抗体分子。该技术路线为快速获得具有药用价值的人源抗体提供了参考。