一种用于筛选启动子元件库的酵母检测载体的构建及初步应用

天然药物合成生物学技术是一种采用多基因控制的方式,实现天然产物代谢途径在异源底盘细胞中的重构。启动子是调控基因表达的一种顺式元件,对多基因控制的代谢途径的平衡起着重要的作用。为了筛选获得性能优越的启动子用于多基因控制的代谢途径,一个基于红色荧光蛋白的酵母检测质粒被构建。首先,根据已经发表的红色荧光蛋白基因,设计并合成了一系列引物,通过连续重叠pcr的方法合成了全长红色荧光蛋白基因dsred-monomer,并将该红色荧光蛋白基因导入酿酒酵母,sds-page、westernblot以及荧光显微镜观察都表明该红色荧光蛋白基因在酿酒酵母中获得了表达。然后,将具备功能的dsred-monomer基因与酿酒酵母表达载体pgbt9进行重组,获得能进行启动子文库筛选的启动子检测质粒pgbt9red。为了检测该质粒的效能,通过pcr从酿酒酵母基因组中克隆得到了6种启动子(包括4种诱导型启动子和2种组成型启动子),并将6种启动子分别克隆到pgbt9red中,置于红色荧光蛋白基因dsred-monomer上游,通过荧光成像确定启动子对红色荧光蛋白基因表达的调控效率。结果表明,6种启动子(gal1、gal2、gal7、gal10、tef2和pgk1)在酿酒酵母中均能调控dsred-monomer的表达。该检测质粒的成功构建为进一步进行启动子活性分析和启动子元件文库筛选奠定基础。