凹耳蛙mhcii类b基因第二外显子多态性分析

？两栖类正经历全球范围内的种群衰退,很多两栖动物集群灭绝事件与环境病原体(如壶菌(batrachochytriumdendrobatidis)的侵扰有关。mhc基因的表达产物在有颌脊椎动物免疫应答过程中起关键作用,其多态性通常与动物对疾病的抗性或易感性密切相关,因而被认为是研究动物适应性进化的最佳候选基因之一。本文对中国特有的无尾两栖动物凹耳蛙(odorranatormota)mhcii类b基因多态性进行初步研究。首先,利用1对通用引物扩增出凹耳蛙mhcii类b基因exon2长约180bp的dna片段。在此基础上,利用ligation-mediatedpcr进一步获取侧翼未知序列,序列拼接后长2,030bp,包含exon2以及intron1和intron2的部分序列。基于上述序列设计出凹耳蛙b基因exon2特异性引物(iiq1bu/iiq1bd),对该物种黄山种群32个样品进行pcr扩增和克隆测序,共获得34个不同的等位基因,等位基因序列核苷酸和氨基酸变异位点的比例分别为16.17%(33/204)和26.87%(18/67),大多数氨基酸变异位点位于推测的抗原结合位点(antigenbindingsites,abs)。每个样品包含2–5个等位基因,结合等位基因序列特征以及cdna表达分析结果,推测凹耳蛙至少拥有3个可表达的b基因座位。与文献报道的蛙科其他物种比较后发现,尽管凹耳蛙目前的分布区非常狭窄,但其mhcii类b基因多态性明显高于蛙科其他动物。等位基因碱基替换模式提示凹耳蛙mhcii类b基因曾经历过强烈的正选择作用,abs区的dn值显著大于ds(p<0.05),paml软件包codeml程序中不同模型的似然比检测(likelihoodratetest)结果同样支持上述推论,贝叶斯经验贝叶斯路径(bayesianempiricalbayes)共检测出5个显著受正选择作用的氨基酸位点。贝叶斯系统树的拓扑结构显示,无尾两栖类不同科的等位基因分别形成单系群,但蛙科不同属的等位基因未能形成单系群,蛙属绿池蛙(ranaclamitans)的1个等位基因与臭蛙属凹耳蛙的部分等位基因享有共同的谱系关系,提示蛙科不同属间的b基因存在跨种多态性。