pegfp-loxp-lox2272载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化

？通过插入型打靶和重组酶介导的盒式交换反应相结合的两步法技术路线将绿色荧光蛋白基因定点整合到牛胎儿成纤维细胞的y染色体上，并利用体细胞核移植技术生产转基因公牛，在这种转基因公牛生产的精液中，绿色荧光蛋白特异性的富集在y精子中，利用这种精液生产性控精液能够大幅提高生产效率。本研究通过特殊的引物设计和高保真酶pcr扩增相结合的方法完成了对pegfp-n3载体的改造，成功的构建了pegfp-loxp-lox2272载体，同时为载体的改造提供了一种有效的方法。利用pegfp-loxp-lox2272载体对牛胎儿成纤维细胞进行的转染，利用不同浓度的g418筛选g418抗性细胞克隆点，在g418浓度为600μg/ml的全培养基中筛选到了一些细胞克隆点，利用克隆环将这些细胞克隆点挑取至48孔细胞培养板进行扩大培养，其中的一个细胞克隆点成功的扩大培养至六孔细胞培养板中的一孔。本试验的结果为牛y染色体基因打靶阳性细胞的筛选工作提供了重要的技术参考。