水稻简易rnai载体构建及沉默效果鉴定

？rna干扰(rnai)技术是研究基因功能的一种常用方法，为了快捷高效地构建水稻(简易rnai表达载体，本研究采用简易rnai构建法，设计3'末端9个碱基互补的正向和反向寡聚核苷酸引物，通过聚合酶延伸成为具有反向重复序列的小干扰片段。以pcambia1301-gt13a为表达载体，将小干扰片段与表达载体经过一次双酶切与连接得到rnai载体。用农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)介导法得到水稻(oryzasativassp.japonica)转基因株系后，用叶片gus染色和qrt-pcr法，对rnai转基因水稻和野生型日本晴叶片gus组织活性和籽粒中目的基因表达量进行检测。水稻叶片gus染色结果显示，有10株转基因水稻叶片切口处呈现蓝色，而野生型无显色反应，说明rnai载体t-dna区域的基因已整合到水稻基因组上，并表达。在mrna水平上转基因水稻籽粒中目的基因相对表达量降低至18%~55%，差异极显著(p<0.01)，表明整合在水稻基因组上的小干扰片段能降低目的基因的表达水平。籽粒灌浆成熟后对10株转基因水稻及野生型日本晴籽粒的单粒重、粒长、粒宽和厚度分别进行测量。与野生型日本晴相比，转基因水稻籽粒单粒重发生显著性降低(p<0.05)，籽粒变小，长和宽都发生显著性变化(p<0.05)，说明简易rnai载体对水稻目的基因的表达起到很好的沉默效果。本研究不仅为利用简易rnai构建法研究水稻功能提供了依据，也为快捷高效地研究水稻基因功能提供了基础资料。