靶向山羊δfosb基因的shrna重组干扰腺病毒的制备及鉴定

？δfosb作为fosb的一种截短型，具有广泛的生物学功能，在脂、钙沉积和药物成瘾等方面有重要作用。本研究采用rna干扰技术，通过制备重组干扰腺病毒对山羊(caprarhircus)δfosb基因进行沉默，进一步研究山羊δfosb基因在脂、钙沉积方面的相关功能及作用机制。实验采用block-itshrna腺病毒干扰系统，将预先设计好的寡聚shrna-492/572经退火复性后克隆入穿梭质粒pentr/cmv-gfp/u6中。经干扰效率检测后，选择pentr/cmv-gfp/u6-572与病毒骨架质粒pad/pl-dest进行同源重组，获得重组干扰腺病毒载体pad/pl-dest/cmv-gfp/u6-572，并转染hek-293细胞，经包装、扩增后即可产生干扰腺病毒ad-δfosb-572，tcid50法测定其滴度为1.58×109pfu/ml。用ad-δfosb-572感染山羊的乳腺上皮细胞(moi=200)，经westernblot及实时定量pcr检测证明在病毒感染24、48和72h后，山羊乳腺上皮细胞中δfosbmrna表达量分别下调了45%，73%和81%，其蛋白表达水平也明显下调，干扰效果明显，可用于后续的基因功能研究。