弹性蛋白酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

？本研究以一株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组dna为模板，经pcr扩增得到的弹性蛋白基因，与genbank中的序列对比发现同源性为99%。将弹性蛋白酶基因连入到表达载体ppic3.5k中，经过酶切和测序鉴定证实弹性蛋白酶基因已插入到载体启动子下游，成功构建了质粒ppic3.5k/pae。将ppic3.5k/pae线性化，通过电转化将目的基因转入毕赤酵母km71中，利用md培养基筛选到近400个转化子，再经g418抗性的筛选，获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子并用pcr和弹性蛋白平板验证。经过甲醇诱导表达得到高表达的重组酵母菌株，酶活为1060u/ml是出发菌株的26倍。本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础。