农杆菌vird2蛋白的定位特异性改造

？农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)vird2蛋白具有与单链t-dna(sst-dna)共价结合并将其转运至植物细胞核，将外源基因高效整合进核基因组的功能；如果将该蛋白改定位于质体，则有可能利用其将外源基因携带进质体，建立质体转化新方法。本研究对vird2蛋白的定位信号进行了改造，采用重叠延伸pcr突变技术对vird2的n端核定位信号(nls)编码序列进行点突变，对c端编码序列实施缺失突变，并在合成的突变vird2(mvird2)基因3'端连接上增强绿色荧光蛋白(egfp)报告基因，在其5'端加上或不加源自拟南芥(arabidopsisthaliana)冷调节基因(atcor15a)的质体定位信号肽编码序列，分别构成pt-mvird2-egfp和mvird2-egfp嵌合基因，由camv35s启动子控制，经农杆菌介导整合进烟草(nicotianatabacum)核基因组。荧光检验显示，mvird2带质体定位信号时绿色荧光集中于叶绿体，mvird2不带质体定位信号时绿色荧光弥散在细胞质中，且两者的细胞核均无荧光，表明pt-mvird2-egfp嵌合基因表达的蛋白具有质体定位特性，并失去了核定位能力。该结果为今后探讨利用pt-mvird2融合蛋白将外源dna主动定向牵引进质体，实现质体高效转化研究提供基础资料。