绵羊肺炎支原体(mycoplasmaovipneumoniae)丙酮酸脱氢酶e1-α亚单位基因(pdha)的克隆、表达及其免疫学活性测定

？丙酮酸脱氢酶α-亚单位(pdha)在病原体丙酮酸脱氢酶的催化过程中发挥着重要作用。为表达绵羊肺炎支原体(mycoplasmaovipneumoniae)pdha蛋白并测定其免疫学活性，应用pcr方法扩增出绵羊肺炎支原体pdha基因并对其序列进行分析，将pdha基因中色氨酸密码子tga优化为tgg后进行全基因合成，插入到pet32-a(+)载体上，构建了pet32-a(+)-pdha重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌(escherichiacoli)bl21中诱导表达pdha蛋白，并通过免疫印迹及小鼠(musmusculus)免疫试验对其免疫学活性进行测定。结果pdha基因全长1125bp，编码375aa，(g+c)%为34.76%，第304~306位、379~381位、586~588位、592~594位、625~627位、811~813位、889~891位及964~966位tga在支原体中编码色氨酸而不是作为终止密码子；基因序列比对及进化树分析显示，绵羊肺炎支原体pdha基因与10种支原体的pdha基因序列同源性为32.6%~85.3%，氨基酸序列同源性为39.3%~90.6%，基因序列和氨基酸序列均与猪肺炎支原体(m.hyopneumoniae)有同源性，分别为85.3%和90.6%；绵羊肺炎支原体pdha基因在33℃、iptg0.25mmol/l诱导6h的表达条件下，表达量最高；重组的pdha蛋白可与绵羊肺炎支原体高免血清具有免疫印迹条带，在免疫小鼠后血清抗体效价与对照组相比，均显著升高(p<0.05)。本实验首次成功克隆表达了绵羊肺炎支原体pdha基因，并证明其重组pdha蛋白具有较好的免疫学活性。为绵羊支原体肺炎基因工程疫苗及诊断研究提供候选靶标。