适用于稻瘟病菌基因敲除、过表达和荧光融合蛋白表达载体的构建和使用

？本研究意在提供一系列适于稻瘟病菌(magnaportheoryzae)的基因敲除、过表达和荧光蛋白融合表达，并且操作简单、耗时短、稳定可靠的通用载体，为系统研究稻瘟病菌的基因功能提供便利。通过pcr、克隆、酶切、连接等分子生物学方法，克隆了2个在菌丝和附着胞阶段都强力表达的启动子(sod1启动子和h3启动子)；构建了14种载体：3种稻瘟病菌基因敲除载体(pbs-sur、pbs-bar和pbs-neo)、4种丝状真菌基因过表达载体(pkd5、pkd6、pkd61和pkd8)和7种丝状真菌荧光融合蛋白载体(pkd5-gfp、pkd5-red、pkd6-gfp、pkd6-red、pkd7-red、pkd8-gfp和pkd8-red)；并提供了这些载体在丝状真菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达中的应用方法。使用构建的基因敲除载体通过原生质体及atmt转化最多同时在稻瘟病菌中敲除了4个基因；用pkd5-red、pkd6-gfp和pkd6-red转化稻瘟病菌后，发现sod1启动子和h3启动子控制下的绿色和红色荧光蛋白在稻瘟病菌中强力表达，real-timepcr结果证实sod1启动子指导下的egfpmrna表达量是β-tubulin的2.5倍，sod1启动子指导下的dsred2mrna表达量是β-tubulin的5.4倍，而h3启动子指导下的dsred2mrna表达量是β-tubulin的20.8倍；moatg8-dsred2的融合蛋白(使用pkd6-red)可以正确定位moatg8于小泡附近；sod1启动子驱动的dsred2(使用pkd6-red)可以在稻瘟病菌的菌丝、孢子、附着胞等各个发育阶段表达。这些实验说明14种载体可以用于稻瘟病菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达，也可用于镰刀菌等其他丝状真菌的基因功能研究。