猪h1foo基因的克隆与真核表达载体的构建

？卵特异性连接组蛋白(oocyte-specificlinkerhistoneh1,hlfoo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白，它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用。本研究旨在克隆猪h1foo基因，并构建其真核表达载体。首先利用5'race和rt-pcr的方法获得猪h1foo基因的cds区，并提交genbank，登录号为hq915640；然后将h1foo基因的cds区连接到载体pmd19-t上，经酶切后定向克隆到表达载体pvenus上，从而构建pvenus-h1foo真核表达载体；用脂质体2000介导重组质粒pvenus-h1foo转染hela细胞，荧光显微镜下观察、rt-pcr检测，确定重组质粒在hela细胞内的表达和定位；最后通过体外转录试剂盒将h1foo-venus体外转录为mrna，并显微注射至猪卵母细胞，荧光显微镜观察其表达和定位。序列分析表明猪hlfoo基因cds区全长1041bp，编码346个氨基酸，蛋白分子量为36.45kd，在核苷酸水平上与牛、人和小鼠h1foo基因的相似度分别为75.7%、67.9%和54.3%；真核表达载体pvenus-h1foo转染后，能在hela细胞中表达并可以准确的定位在细胞核；体外转录的h1foo-venusmrna显微注射猪卵后其融合蛋白也能准确定位于细胞核。本研究克隆了猪h1foo基因并成功构建其真核表达载体；体外转录的h1foo-venusmrna能在猪卵中正确表达和定位，为进一步研究h1foo在猪卵母细胞成熟以及核移植过程中的作用提供了基础资料。