同步检测海水养殖动物5种病原菌的扩增子拯救多重pcr(arm-pcr)方法的建立与应用

？鳗弧菌(vibrioanguillarum)、哈维氏弧菌(v.harveyi)、嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)、迟缓爱德华氏菌(edwardsiellatarda)和副溶血弧菌(v.parahaemolyticus)是我国海水养殖动物5种重要的病原菌。本研究在分析了其致病因子基因的基础上，依据扩增子拯救多重pcr(arm-pcr)的原理，设计了5套特异性的套式pcr引物，并在各内引物的5'端分别加上能被一对通用引物识别的标签序列；通过对套式pcr中影响扩增结果的引物混合物浓度、退火温度、mg2+浓度、dntps浓度以及taqdna聚合酶浓度等5个反应参数的调整和优化，最终建立了一种能同步检测海水养殖动物5种常见病原菌的arm-pcr方法。优化后的arm-pcr方法第一步pcr反应体系为：10×pcrbuffer5μl(含20mmol/l的mg2+)，dntp(各2.5mmol/l)5μl，taq酶(2.5u/μl)0.6μl，10×primermix(2μmol/l)5μl，dna模板各1μl，灭菌双蒸馏水补足至50μl，反应的退火温度为55℃。实验结果表明：对鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和副溶血弧菌这5种病原菌，使用该方法可以在1支反应管内快速、同步进行检测，得到大小分别为144、190、266、315和371bp的特异性产物，其检出灵敏度分别为1.745、1.847、16.000、28.126和369.900pg细菌基因组dna；该方法特异性强，与大肠杆菌(escherichiacoli)、溶藻弧菌(v.alginolyticus)、河豚毒素假交替单胞菌(pseudoalteromonastetraodonis)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)等其他细菌以及半滑舌鳎基因组dna不产生交叉反应。2012年，应用该arm-pcr方法对分离自病鱼的24个优势菌株进行了检测，确定出5株迟缓爱德华氏菌、3株嗜水气单胞菌、2株哈维氏弧菌及2株副溶血弧菌，证实该方法具有良好的可靠性和实用性。该方法不仅适用于海水养殖动物中致病性鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌的快速、同步检测和病原流行情况调查，也为进一步开发相应的基因芯片检测方法打下了基础。