猪腺苷酸活化蛋白激酶α基因(ampkα)特异性sirna载体的构建及干扰效果评价

？腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase,ampk),在真核细胞生物中广泛存在，是调控机体能量代谢的关键酶。本研究旨在构建并筛选猪(susscrofa)ampkα基因的有效sirna干扰载体，并探讨ampkα基因对脂肪分解关键酶基因表达的影响。根据猪ampkα基因(genbank登录号：nm-001167633)全长cdna序列，设计合成其特异性发夹sirna干扰片段，将其克隆插入psilencer4.1-cmvneovector干扰载体中，构建猪ampkα基因的sirna真核表达载体ra1和ra2，并通过pcr、双酶切和测序对其进行鉴定。构建成功后转染猪肌内脂肪前体细胞并检测其干扰效果及对脂肪分解关键酶——激素敏感脂肪酶(hormonesensitivelipase,hsl)、脂肪甘油三酯脂肪酶(adiposetriglyceridelipase,atgl)和肉毒碱棕榈酰转移酶(carnitinepalmitoyltransferase,cpt1)基因表达的影响。结果表明，所构建的猪ampkα基因的特异性sirna表达载体ra1和ra2均可降低猪ampkαmrna表达(p＜0.05)，而且ra2干扰效果优于ra1。用ra2干扰ampkα后，猪肌内脂肪前体细胞中ampkα及脂肪分解关键酶hsl、atgl和cpt1基因表达量显著下降(p＜0.05)。提示，抑制ampkα基因表达后，猪肌内脂肪前体细胞中脂肪分解和脂肪酸氧化速率降低。本研究结果为深入探讨ampkα对猪脂肪代谢的影响机制及通过营养调控基因表达进而调控猪体脂沉积提供基础资料。