腺病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白2基因(srebp2)过表达载体的构建与鉴定

？固醇调节元件结合蛋白2(sterolregulatoryelementbindingprotein2,srebp2)属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族，在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作用。克隆秦川牛(bostaurus)的srebp2基因并构建相应腺病毒过表达载体，包装扩繁获得高滴度腺病毒，对于在细胞水平上研究srebp2基因的功能和作用机制具有重要作用。本研究以秦川牛脂肪组织为实验材料，提取总rna并反转录为cdna，依据genbank收录的牛的srebp2基因(accessionno.nm_001205600)mrna序列设计引物，克隆出srebp2基因编码区(codingsequence,cds)全长。将srebp2基因与穿梭载体连接构建padtrack-cmv-srebp2表达载体，用pmeⅰ分别酶切线性化padtrack-cmv-srebp2和空白对照padtrack-cmv载体并转化含有骨架载体padeasy-1的大肠杆菌(escherichiacoli)bj5183感受态进行同源重组，得到腺病毒重组载体pad-srebp2和pad-cmv，分别用pacⅰ酶切后胶回收dna大片段，并将回收产物转染293a细胞包装得到腺病毒ad-srebp2和ad-cmv，增殖并提高病毒滴度，得到高滴度病毒后，用绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,gfp)标记法测定显示ad-srebp2和ad-cmv的病毒滴度分别为7×108和1.3×109gfu/ml。将ad-srebp2和ad-cmv腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞检测病毒的有效性，实时定量pcr检测结果显示，侵染48h时srebp2基因的表达量提高了102.3倍。本研究成功克隆了秦川牛的srebp2基因，构建了病毒重组体，包装增殖获得了高滴度病毒，为在细胞水平上基因功能的研究提供了基础资料。