对虾白斑综合征病毒可视化环介导等温扩增(lamp)检测技术的建立与应用

？针对当前对虾(penacusorientalis)养殖业亟需研究开发一种简便快速、敏感特异的检测技术来实现对对虾白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus,wssv)进行检测监控的现状，本研究根据wssv基因组orf120保守区序列，设计合成6条环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification,lamp)特异性引物，分别为外引物f3/b3、内引物fip/bip和环引物lf/lb。利用钙黄绿素/氯化锰作为检测指示剂，通过对反应条件优化，建立了可视化wssv-lamp检测方法。在检测中未发生扩增反应时，钙黄绿素被氯化锰螯合，呈淬灭状态。当样品中有wssv靶基因存在时，大量dna被合成，并产生同样大量的焦磷酸根离子，此时焦磷酸根离子竞争性与mn2+结合，形成稳定的不溶性焦磷酸盐沉淀，钙黄绿素被释放而发出肉眼可见的黄绿色荧光。该扩增一次性反应约60min即可完成对待检样品的检测。经测定，本方法能特异性地检测出阳性样品中的wssv目的基因，并能通过扩增产物所产生的黄绿色变化与阴性样品区别；本技术对目的基因的最低检测量为1fg。在临床检测试验中，wssv-lamp与世界动物卫生组织(oie)推荐的wssv-pcr检测方法均能从250份对虾样品中，同时检测到15份编号相同的阳性样品，符合率达100%。除此之外，wssv-lamp还能从另外3份pcr检测为阴性的样品中检测到目的基因。比较这两种方法的阳性检出率，wssv-lamp为7.2%(18/250)，wssv-pcr为6.0%(15/250)，wssv-lamp对自然感染的临床样品阳性检出率要比wssv-pcr高。说明wssv-lamp在病毒含量较低的临床样品检测中比oie推荐的pcr方法具有更高的技术优势，能在对虾养殖生产上的临床诊断、育种及口岸检疫，甚至海洋生态监测中对wssv进行现场检疫。