大麻素ⅰ型受体基因(cnr1)特异性sirna表达载体的构建及稳定干扰阳性l6细胞克隆的筛选

？大麻素ⅰ型受体(cnr1)是介导内源性大麻素发挥作用的关键分子，在食欲和能量代谢调控中发挥着重要作用。为了更深入研究cnr1的基因功能,本实验旨在构建和筛选有效沉默cnr1基因的干扰表达载体，并筛选出稳定转染干扰质粒的阳性细胞系。设计合成3对cnr1基因的特异性发夹小干扰rna(sirna)干扰引物，将其连接入干扰载体pyr-1.1，构建可沉默cnr1基因的sirna表达载体cnr1-1、cnr1-2和cnr1-3。并采用lipofectaminetm(lip)2000介导质粒转染l6细胞，绿色荧光蛋白的表达和流式细胞仪监测转染效率，通过实时荧光定量分析sirna表达载体的干扰效果。并进一步用g418进行了稳定转染细胞筛选。结果显示，cnr1基因的sirna表达载体构建正确，瞬时转染l6细胞的转染效率分别为10.45%(p<0.01)、8.57%(p<0.01)和8.71%(p<0.01)；干扰效率为39%(p<0.05)、64%(p<0.01)及68%(p<0.01)。稳定筛选的最佳g418浓度为800μg/ml，稳定筛选后干扰效率分别为43%(p<0.05)、78%(p<0.01)及91%(p<0.01)。干扰效率较高的cnr1-3表达载体和稳定转染cnr1-3的细胞系为构建筛选成功的sirna表达载体和阳性细胞系。本研究提供了一种有效沉默cnr1基因表达的方法，同时稳定沉默的阳性l6细胞系成功筛选为进一步研究大麻素ⅰ型受体的基因功能提供了基础资料。