莴苣叶绿体转化体系的初步建立

？作为人们广泛食用的叶用蔬菜，莴苣(lactucasatival.)一直被科学家认为是一种理想的植物生物反应器平台。本研究首先以生产上常用的两个莴苣品种美国大速生(grandrapid)与香港玻璃生菜(hongkongglass)的叶片为外植体，放置在添加不同激素成分的培养基中诱导再生小芽，在生根培养基上生根后即建立了组织培养再生体系；依据两个莴苣品种在不同培养基中的诱导再生率、出芽效率和生根率，确定表现较好的品种美国大速生作为后续叶绿体遗传转化外植体的供体。其次，根据莴苣叶绿体基因组16s-trni-trna-23s区域的序列，设计特异引物，利用pcr扩增技术获得上述区域的部分片段，并作为同源重组序列插入t载体中；在同源重组序列中的ecl136ⅱ酶切位点处，插入带有绿色荧光蛋白基因(gfp)和aada抗性筛选基因的化学合成表达框，构建适合莴苣叶绿体转化的特异表达载体ptle，其中表达框内为gfp基因，壮观素酶抗性基因(aada)具有壮观霉素和链霉素抗性。最后，利用基因枪轰击法将ptle载体转化到莴苣叶绿体基因组中，在含有30mg/l壮观霉素的培养基中进行两轮抗性筛选后，pcr分子检测和绿色荧光观察证明：获得的莴苣叶绿体转化植株仍处于杂合状态，还未达到完全同质化的程度。上述研究结果表明，已经初步建立了莴苣叶绿体的遗传转化体系，为进一步获得同质化纯合体和后续的植物生物反应器研究与开发提供了基础资料。