表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)感染性克隆的构建及病毒拯救

？为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)反向遗传操作平台，本研究在prrsvhun4-f112疫苗株感染性分子克隆的基础上，采用突变pcr技术将新城疫病毒(ndv)np蛋白末端优势抗原区插入prrsvnsp2蛋白的复制非必须区，经基因片段的克隆、拼接，构建了含有外源标记基因的感染性的prrsvcdna克隆psk-hun4-f112-δ52+np49。用限制性内切酶swaι将psk-hun4-f112-δ52+np49线性化后通过细胞外转录获得病毒rna，用脂质体法将病毒rna转染叙利亚仓鼠肾细胞(bhk-21)包装出病毒粒子，再转接到猴胚胎肾上皮细胞(macr-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行rt-pcr扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明，拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的mluⅰ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明，外源基因np49在拯救的prrsv中表达，且能够在prrsv传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示，拯救病毒与亲本病毒在marc-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因prrsv的感染性克隆并获得了拯救病毒，为进一步开发新型prrs疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。