结核分枝杆菌cfp10-esat6融合蛋白的真核表达及其牛结核病诊断价值评价

？本研究旨在利用毕赤酵母(pichiapastoris)系统融合表达结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,mtb)的培养滤液蛋白10(culturefilterprotein10,cfp10)和早期分泌抗原靶6蛋白(earliersecretedantigentarget6,esat6)，并评价其作为牛结核病外周血γ-干扰素(interferongamma,ifn-γ)体外释放实验特异性刺激剂来诊断牛结核病的应用潜能。通过pcr扩增cfp10-esat6融合基因，构建ppiczαa-(cfp10-esat6)重组质粒，电转化毕赤酵母gs115，添加甲醇至终浓度1.0%，诱导3d，取培养上清进行sds-page分析，镍离子金属螯合亲和层析柱纯化目的蛋白，westernblot分析重组蛋白的免疫反应性；取纯化的融合蛋白cfp10-esat6作为刺激剂用于牛结核病外周血ifn-γ体外释放实验，评价其牛结核病诊断价值。结果表明，目的蛋白(33kd)被成功分泌表达，该融合蛋白与抗cfp10、esat6、组氨酸标签和c-myc4种单抗均发生特异性反应，具有较好的免疫反应性。165份奶牛外周血样品的ifn-γ检测结果表明，cfp10-esat6融合蛋白与结核菌素纯蛋白衍生物(purifiedproteinderivative,ppd)作为刺激剂，二者阳性符合率为82.3%，阴性符合率为78.8%。本研究利用酵母表达系统成功表达cfp10-esat6融合蛋白，并表现出更高的生物学活性，在牛结核病外周血ifn-γ体外释放实验中可作为候选刺激剂，并能克服混合感染导致的ppd漏检问题，从而进一步提高检测的敏感性和特异性。