半滑舌鳎3d-bac池构建及性别连锁标记的物理定位

？半滑舌鳎(cynoglossussemilaevis)属于雌配子异形染色体性别决定机制(zw/zz)，其w染色体包含的大量重复序列阻碍了w染色体序列的精确组装。目前只有物理图谱可以有效地解决由重复序列所造成的组装难题。本研究在已有物理图谱和遗传图谱的基础上，利用3d(three-dimensional)-bac(bacterialartificialchromosome)池构建和pcr筛选策略进行了性别连锁标记的物理定位。首先将所选44个384孔板的bac克隆进行接种和预培养，再接种到4个96孔深孔板中。将每两个384孔微孔板的bac克隆分别汇集获得相应的板池、行池和列池，在提取dna后，再将相应板池的部分dna混合得到超级池。最终构建的3d-bac池，共包括22个超级池和440个基池，覆盖半滑舌鳎基因组4.2倍，完成一个阳性超级池的基池筛选只需24个反应(20个bac基池和4个对照)。然后选用159个半滑舌鳎性别连锁标记对这些克隆池进行两步pcr筛选。在对超级池的筛选中，有142个标记获得阳性扩增。对这些阳性超级池进行基池筛选后，最终有100个标记得到准确定位。定位到半滑舌鳎物理图谱的84个重叠群(contigs)和20个单个克隆(singletons)上，共计1760个克隆，包含有21927个共享条带，物理长度为42.4mb，覆盖半滑舌鳎基因组约5.3%；确定一个定位关系(contig与标记之间的)平均使用了2.2个克隆。在这些标记中，有17个同时定位到了两个或两个以上的contigs上，有11个标记同时定位到contigs和singletons上。另外有19个contigs定位了2个或2个以上标记。这些性别连锁标记的物理定位将有助于半滑舌鳎性染色体基因组序列的精确组装。