苦荞细胞色素cyp81家族同源基因ftp450-r4的克隆、分子鉴定及其功能分析

？细胞色素p450(cytochromep450,cyp450)是高等植物中最大的酶蛋白家族之一，广泛参与植物的次生代谢和抗逆生理。本研究采用同源克隆和cdna末端快速克隆(rapid-amplificationofcdnaends,race)技术，获得苦荞(fagopyrumtataricum)cyp81家族同源基因ftp450-r4(genbank登录号:km271986)。ftp450-r4cdna全长1770bp，5'-utr为49bp，3'-utr为194bp，orf为1527bp，其orf序列可编码508个氨基酸残基的蛋白。生物信息学分析表明，ftp450-r4蛋白通过n-端4~24位氨基酸残基定位于内质网，与f3'h(flavonoid3'-hydroxylase)、i2'h(isoflavone2'-hydroxylase)和其他cyp450的同源性在44%~46%之间；多重序列比对显示，ftp450-r4具有cyp450中经典的基序和保守序列，但不含f3'h的特征基序(ggek)；系统进化树分析显示，ftp450-r4与拟南芥(arabidopsisthaliana)cyp81家族和i2'h聚为一大簇，说明其可能参与苦荞黄酮类化合物的羟化或对逆境胁迫的应答。uv-b、寒冷和干旱均能引起ftp450-r4在苦荞子叶中表达量的显著变化，而在胚轴中其表达量变化不显著。利用大肠杆菌(escherichiacoli)bl21(de3)菌株对ftp450-r4蛋白进行了可溶性表达，活性鉴定表明，重组ftp450-r4蛋白能以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reducedformofnicotinamide-adeninedinucleotidephosphate,nadph)和山奈酚为底物进行酶促反应，具有生物学活性。本研究可为了解cyp450在黄酮合成代谢中的功能，明确苦荞黄酮代谢调控的分子机制提供了基础资料。