调控山羊乳腺脂肪酸代谢mirnas筛选及相关pri-mirnas克隆验证

？microrna(mirna)是调控脂类代谢的重要分子。本研究采用数据库预测和自由能分析法，筛选与山羊(caprahirus)乳腺脂肪酸代谢相关的mirna，并对预测得到的mirna进行克隆验证。预测结果表明，通过microcosm、targertscan和pictar3个在线数据库预测与山羊脂肪酸代谢相关的30个基因相对应的mirna，预测得到50条mirna，其中3个数据库预测一致的mirna为13条，2个数据库预测一致的为37条。结果显示，脂肪酸合酶基因(fasn)对应4个不同的mirna，嗜乳脂蛋白基因(btn1a1)对应2个，而磷酸甘油酰基转移酶6基因(agpat6)没有预测到mirna靶位点；fasn与btn1a1的3'utr上mir-103的结合位点分别有3个和2个。通过mfold软件对预测所得的50条mirna靶位点两侧序列的自由能(δg＞-20kcal/mol)进行分析，9种mirna与调控脂肪酸代谢基因相关度较高，分别为mir-103/btn1a1、mir-15/fasn、mir-23/lpl(脂蛋白酯酶)、mir-27/pparγ(过氧化物酶体增殖物激活受体)、mir-29/gpr41(短链脂肪酸受体)、mir-146/btn1a1、mir-195/fasn、mir-200/scd(硬脂酰辅酶a去饱和酶)和mir-497/gpr41，其中mir-103/27/195分别位于btn1a1、pparγ和fasn的靶位点与已知物种间同源性较高，增加了这些mirna/mrna结合的可能性。此外，靶位点单侧和双侧δg小于阈值的mirna/mrna分别为14对和9对，其中mir-27/mrna预测的靶基因为4个，依次为fasn、acox1(乙酰辅酶氧化酶基因1)、lpl和pparγ，mir-103和mir-15的靶基因同为fasn、btn1a1和acox1。以西农萨能奶山羊(caprahirus)基因组dna为模板，可扩增出与5条mirna(mir-103-1/23a/27a/146b/200a)分别相对应的初级mirna(pri-mirna)；通过序列分析和二级结构分析表明，5条pri-mirna均包含完整的pre-mirna序列，同时具有典型的茎环结构，能够产生相应的mirna。与牛的同源性分析表明，除pre-mir-27a同源性为98%外(山羊pre-mir-27a3'端第11个碱基为g，而牛为a)，其余4条pre-mirna同源性均为100%。因此，本研究筛选的9种mirna可能调控山羊乳腺脂肪酸代谢，克隆的5条pri-mirna为其功能研究提供基础。